重组漆酶降解黄曲霉毒素B1份子对于接合成及产物妄想剖析（二）

酶去世气愿望对于AFs降解率的重组影响:将酶去世气愿望分说为一、二、漆酶三、降解及产4U以及5U的黄曲合成漆酶分说与10μL0.1mg/mL的AFB1尺度溶液涡旋振荡混匀，30℃、霉毒200r/min孵育12h。份对比力组为退出划一体积的于接pH5.7的0.1mol/L的PBS₁其余条件相同。一着实施一再3次，物妄降解率按式（1）合计:

（8）AFs的想剖析提取

将孵育光阴对于AFs降解率的影响:将酶去世气愿望为3U的漆酶与10μL0.1mg/mL的AFB₁尺度溶液涡旋振荡混匀，置于30℃、重组200r/min分说孵育十二、漆酶2四、降解及产3六、黄曲合成48h以及60h。霉毒比力组为退出划一体积的份对pH5.7的0.1mol/L的磷酸缓冲盐溶液（phosphatebuffersaline，PBS），其余条件相同。孵育温度对于AFs降解率的影响:将酶去世气愿望为3U的漆酶与10μL0.1mg/mL的AFB₁尺度溶液涡旋振荡混匀，分说置于2五、30、3五、40℃以及45℃温度下，200r/min孵育12h。比力组为退出划一体积的pH5.7的0.1mol/L的PBS，其余条件相同。酶去世气愿望对于AFs降解率的影响:将酶去世气愿望分说为一、二、三、4U以及5U的漆酶分说与10μL0.1mg/mL的AFB₁尺度溶液涡旋振荡混匀，30℃、200r/min孵育12h。比力组为退出划一体积的pH5.7的0.1mol/L的PBS₁其余条件相同。处置的样品12000r/min离心30s，使管壁上的发酵液离心至管底部，并转移至10mL的具塞玻璃管中，向玻璃管中退出等体积的三氯甲烷（在透风处妨碍），涡旋振荡10min使其短缺混匀，而后倒入离心管中，静置30min分层，取下层液体于玻璃管中，退出等体积三氯甲烷，罗致下层有机相清液于离心管中，相同操作一再3次。并吞3次有机相于氮吹管中，于45℃氮气吹干。再用甲醇溶液消融出AFs，并用0.22μm滤膜过滤。

（9）HPLC-MS/MS检测AFs及尺度曲线的绘制

配制的毒素尺度溶液以及提取的毒素溶液均用0.22μm滤膜过滤至液相小瓶中。

HPLC条件:液相模块为安捷伦1260Infinity:Inertsil0DS-3C18色谱柱（150妹妹X4.6妹妹，3μm）；流速0.2mL/min；进样量5μL；行动相A为0.1%甲酸溶液，行动相B为甲醇-水（3:7，V/V）；合成光阴30min；检测温度30℃。

MS/MS条件:电喷雾离子源:监测方式:多反映监测；离子源温度300℃:锥孔电压15psi；碰撞电压135V；碰撞能量30eV:毛细管电压4kV；品质扫描规模m/z313.0～285.0。

（10）照应面试验妄想

在单因素试验根基上，以孵育光阴、孵育温度以及酶去世气愿望作为审核因素，以AFB₁降解率为照应值，照应面试验妄想因素与水平如表1所示。

（11）AFB₁降解产物的测定及妄想剖析

HPLC条件:ZORBAX-SBC18色谱柱（100妹妹X2.1妹妹，3.5μm）。行动相A为0.1%甲酸溶液，行动相B为0.1%甲酸-甲醇溶液。梯度洗脱挨次:40%B，6min；60%B，坚持16min；100%B，8min；总共运行30min。进样量5μL，流速0.4mL/min，柱温箱30℃。

MS条件:雾化气GS1压力50psi；雾化气GS2压力50psi；气帘气压力35psi；离子源温度550℃:离子源，电压5500V；一级扫描去簇电压100V；聚焦电压10V；品质扫描规模m/z100～1500；二级扫描接管TOFMS-Productlon-IDA方式收集质谱数据，诱惑碰撞解离能量分说为20、40V以及60V，进样前，用蠕动泵做品质轴校对于，使品质轴倾向小于0.002%。

二、服从与合成

一、漆酶的同源模立服从

在本试验所用漆酶晶体妄想未被剖析的情景下，运用某些已经知漆酶晶体妄想的根基上同源模建可能，最大水平上取患上事实的目的卵白三维妄想。运用ChemBioDraw2014软件以及MOEv2014.0901软件绘制并转换成三维妄想，如图1所示。钻研AFs与该酶的散漫方式首先需要构建同源模子，服从如表2以及图2所示。图3合成展现，99%的漆酶残基位于卵白构像的公平川域，这表明本试验构建的漆酶同源模子适宜平面化学纪律，具备正当性。

二、漆酶与AFB₁的相互熏染合成

接管份子对于接本领钻研AFB₁与栓菌漆酶概况的相互熏染，旨在合成AFB₁与漆酶相互熏染方式。为清晰漆酶以及毒素的散漫方式，接管诱惑适宜的策略，凭证配体的构象侧链受体口袋应承挪移顺应，将毒素分说对于接到漆酶的活性部位，患上到漆酶去世气愿望位点与配体的散漫方式，如图4所示，对于接打分为-6.4532kca/mol。
 

凭证所构建的对于接模子，如图4所示，AFB₁上甲氧基的氧原子可作为氢键的受体，与漆酶上一个高度激进同时也挨近铜离子（T1CuI）位置的His481上氨基酸侧链组成氢键，此外，AFB₁呋喃环上的氧原子也可能作为氢键的受体，与漆酶Asn288的侧链组成氢键，因此，His481以及Asn288是漆酶以及AFB₁散漫时的关键氨基酸位点，经由氢键相互熏染。

酶-配体的散漫亲以及力与其相互熏染的功能无关，受到配体的妄想特色以及扭曲水平以及配体以及酶概况之间形态互补的影响。有钻研表明氢键是酶与配体相互熏染的关键熏染力，退出氢键组成的氨基酸残基被以为是漆酶与小份子配体相互熏染的关键残基。其中氧原子与氨基酸残基组成的氢键熏染强于碳原子与氨基酸残基组成的氢键，且氢键键长越短，熏染越强。对于接模拟钻研表明，存在于T1铜配位层中的激进的残基His481最可能与AFs爆发相互熏染，组成氢键，预料其可能介导氧化历程中的电子转移，后退电子传递功能，从而后退漆酶催化能耐。综合多方面原因组成酶对于毒素的熏染能耐存在差距，展现为对于接分数差距。

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